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真菌毒素檢測技術(shù)與產(chǎn)品服務(wù)（4）
發(fā)布時間： 2009/3/27 點(diǎn)擊次數(shù)： 2943次提 供 商： 研域（上海）化學(xué)試劑有限公司 資料大小： 圖片類型： 下載次數(shù)： 3 次 資料類型： 瀏覽次數(shù)： 2943 次 相關(guān)產(chǎn)品： 詳細(xì)介紹： 液相色譜法對飼料中赭曲霉毒素的測定摘要：研究了液相色譜法測定飼料原料和配合飼料中赭曲霉毒素的方法。樣品經(jīng)已腈水（84：16）提取，提取液通過赭曲霉毒素凈化柱凈化、濃縮，C18色譜柱分離，熒光檢測器檢測，外標(biāo)法定量。對添加兩個濃度赭曲霉毒素的玉米樣品進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，平均回收率為99.12%和103.09%，變異系數(shù)RSD分別為0.281%、1.214%，zui低檢測限為0.20ng/kg，方法簡便易行，準(zhǔn)確精密度高，值得推廣。Abstract: HPLC is applied to the determination of ochratoxin A in feed .The sample is extracted with 84/16 acetonitrile/water. Filtrace is cleaned up by ochratoxin purification column. Fluorescent ochratoxin A is separated on NovapakC18 column,and is detected by fluorescent detector and is quantified by external standard. Corn samples are fortified with ochratoxin A at the twe levels. Five replicate analysis are performed each level. The recoveries of ochratoxin A are 99.30%~103.09%.The variation coefficients are 0.281%~1.214%.The detection limit is 0.20ng/kg. The precision and accuracy of this method are satisfactory.Keywords: HPLC； pretreatment ； ochratoxin A霉菌遍布世界各地，種類繁多，依生活習(xí)性，分為倉儲霉菌和田間霉菌，前者指儲存原料和飼料在適宜的溫度、濕度下產(chǎn)生的霉菌，zui適宜溫度為25-30℃，相對濕度80-90%。赭曲霉毒素是溫暖地區(qū)zui重要的倉儲毒素，廣泛存在于玉米、大麥、小麥和飼料中,麩皮的污染高于整粒谷物。廣東地處亞熱帶，溫濕度十分適宜霉菌的生長，據(jù)有關(guān)調(diào)查該毒素污染在原料和配合飼料中普遍存在，陽性率大于60%2。赭曲霉毒素危害很大，致癌性*。據(jù)報道，每千克飼料中含有0.2-0.3克，就可使雞中毒，zui常見的臨床表現(xiàn)有：鈣磷吸收障礙，骨骼脆弱，蛋殼鈣化不全，破蛋率高，皮下出血，容易挫傷。對家畜主要攻擊腎臟、免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)，肝臟變得脆弱，劇渴，生長遲緩，多尿、下痢、糖尿癥。根據(jù)中國國家有關(guān)規(guī)定，赭曲霉毒素的zui高*為：20ug/kg.現(xiàn)常用的檢測方法多為薄層色譜和酶聯(lián)免疫法，薄層色譜法操作繁瑣，污染大、定量差，耗時長，而酶聯(lián)免疫法雖操作簡單，但存在假陽性，準(zhǔn)確性欠佳，此液相色譜法操作簡便，快速，準(zhǔn)確靈敏度高，不失為一種好方法。1.實(shí)驗(yàn)部分：1.1試劑和儀器已腈（色譜純）冰醋酸（分析純）去離子水赭曲霉標(biāo)準(zhǔn)液 PuriToxSR 130赭曲霉毒素凈化柱 液相色譜儀 熒光檢測器1.2步驟1.2.1 取樣：取代表樣品5kg，粉碎，充分混合均勻，四分法縮至500g, 因霉菌毒素分布不均勻，充分混合非常重要，必要時取樣量加大，有地方建議取15kg。1.2.2 提?。喝?/span>25g粉碎樣品于250ml三角燒瓶內(nèi)，加100ml已腈水（84：16），在振蕩器上振蕩1小時，用定量濾紙過濾。1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)備：將50ul 10ug/ml 的赭曲霉毒素在一個棕色瓶子里吹干，用10ml的流動相進(jìn)行溶解，渦旋1分鐘，此為50ng/ml的赭曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)液；另將1 ml10ug/ml的赭曲霉毒素在一棕色瓶子內(nèi)吹干，用10ml的流動相溶解，渦旋1分鐘，此為1ug/ml的赭曲霉加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液。1.2.4 凈化濃縮：取7ml的樣品提取液用PuriToxSR 130赭曲霉毒素凈化柱，然后將凈化液轉(zhuǎn)移4ml的凈化液到另一試管，60℃水浴中氮?dú)獯蹈?，?/span>400ul的流動相（60/40/1水/已腈/已酸）溶解，渦旋30min ，轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管內(nèi)10000轉(zhuǎn)離心5分鐘，轉(zhuǎn)移350ul 的清潔樣品進(jìn)入液相。1. 3儀器條件Waters2695液相色譜儀，2475熒光檢測器色譜柱：NovapakC18（5um） 3.90*150mm Waters PAHC18（5um）4.6*150mm流動相：60/40 水/已腈流速：0.5ml/min 運(yùn)行時間：20min柱溫：40℃進(jìn)樣體積：60ulEX:330nm EM:460nm2.0測定結(jié)果2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程：取制定好的50ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用流動相分別稀釋成1、2、5、10、20、30、50ng/ml的濃度，上液相色譜進(jìn)行檢測，根據(jù)檢測的峰面積對應(yīng)相應(yīng)濃度制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。相關(guān)系數(shù)為0.9995，回歸方程是Y=1.11×105X-1.85×103,檢測限：0.20ng/kg.表1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的基本參數(shù)：Tab.1 Regression equation濃度范圍Concn.Range（ng/ml）1.02.05.010.020.030.050.0峰面積Peak area103454.993210799.985515389.9641064099.9262285364.8403442139..7605463738.891相關(guān)系數(shù)Correlation0.9995回歸方程Regression equationY=1.11×105X-1.85×103檢測限Limit of detection0.20ng/kg（按3倍信噪比計算）2.2不同濃度添加回收實(shí)驗(yàn)：取玉米樣品1份，分別做兩個濃度的添加回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。表2.兩個濃度的樣品添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果表：Tab.2 Recovery test組分Ingtedient本底值Known value（ng/ml）添加標(biāo)準(zhǔn)液的體積10ul35ul赭曲霉毒素0添加處理后理論濃度Added14.28ng/ml50.0ng/ml添加次數(shù)1234512345添加后測得濃度（ng/ml）Found14.1814.1614.1314.2014.1052.0652.1651.1351.6850.69回收率Recovery（%）99.3099.1698.9599.4498.74104.12104.32102.26103.36101.38平均值Average value99.12103.09RSD（%）0.2811.2142.3精密度實(shí)驗(yàn)：選擇不同含量的玉米樣品兩份，分別平行測定8次，結(jié)果見表3表3.精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Precision test檢測次數(shù)12345678平均值RSD樣品1測定值Sample 1 Found（ng/ml）11.2311.4611.4111.3611.8711.9711.6711.7511.592.27樣品2測定值Sample 2 Found（ng/ml）28.5728.6228.6828.9828.8728.1228.9228.5328.660.9633.0結(jié)論：